商品屬性：

描述:

UvsX 重組酶，來源于 T4 噬菌體，是 RecA/Rad51家族的同源體。RecA/Rad51 重組酶家族在雙鏈 DNA 斷裂的無誤修復和復制叉重新啟動的過程中起到重要作用。
T4 UvsX 重組酶可與其他重組酶一起錨定在單鏈 DNA 上并激活其在其他雙鏈 DNA 上尋找同源序列，以進一步完成鏈置換。經檢測，該酶無核酸酶活性。

儲存：

置于-20°C 可保存 1 年，-80°C 長期保存，短期使用置于 4°C，保存一個月，避免反復凍融。
熱失活：60°C，10min。
酶儲存液：50 mM Tris-HCl, 50 mM KCl, 1 mM DTT, 0.1 mM
EDTA, 10% Trehalose, pH 7.5。2xRPA BufferMix：包含反應緩沖鹽、ATP、磷酸肌酸、dNTP、PEG、DTT、BSA 等，可用于 RPA 擴增試驗。該試劑 4°C
條件下放置 1 個月性能無下降。
基于本蛋白進行 RPA 反應測試的全套試劑

用于 RPA 擴增的測試引物與探針
CPV-F（20uM） CACTTACTAAGAACAGGTGATGAATTTGCTACAG
CPV-R（20uM） AGTTTGTATTTCCCATTTGAGTTACACCACGTCT
Probe（10uM） CCTCAAGCTGAAGGAGGTACTAACTTTGGT[dT-BHQ1]
[THF][dT-FAM]ATAGGAGTTCAACAAG -(C3)
Canine parvovirus type 2,VP2
加入 1μl 的模板 DNA，上機反應前加入 1.25 μl 的 280 mMMg(OAC)2（終濃度 14 mM），總反應體積 25 μl?；旌暇鶆颍㈦x心，置于 39-42℃條件下反應 30min。
2. 進行熒光 RPA 擴增在進行熒光檢測時體系中，額外加入 0.3 μl 的 10μM Probe（120 nM的終濃度）和 50U 的 Exonuclease III（2U/μl 的終濃度），即可進行熒光檢測。本方法應用原理為 ExoIII 切割 THF 位點，使熒光與猝滅基團分離，報告熒光信號。
特別說明：
（1） 以上 RPA 擴增測試屬于蛋白功能性測試，按照以上實驗操作流程，可獲得 RPA 擴增產物。進一步的優(yōu)化，包括：X、Y、GP32、聚合酶、反應 Buffer，甚至加樣順序，均可能進一步提高 RPA 的擴增性能。
（2）關于 DNA 聚合酶的選擇， 測試了三種常見的 DNA聚合酶，在進行熒光法測定時，推薦的選擇順序依次為 Bst 4.0>Bsu> Sau，且在 42℃條件下，總能獲得最快的擴增速度，且熒光信號更強。在 Basic 擴增中 Sau 表現出特異性擴增能力更佳。
（3）關于 RPA 的靈敏度與非特異擴增，在 Basic 試劑的擴增中，仍然存在非特異擴增產物，這需要進一步優(yōu)化反應組分及引物序列。在使用熒光探針法時，但由于特異性探針的存在，非特異擴增產物通常無熒光信號值，但此時會影響檢測靈敏度。GP32 蛋白的
濃度增加會顯著降低非特異性擴增，但會導致擴增速度減緩，此時需要同步增加 X 與 Y 蛋白的用量，以維持 RPA 的擴增速度。
（4）據文獻報道，在進行試紙條 RPA 實驗時，傾向使用 Nfo 內切酶又名 Endonuclease IV， 來對擴增探針進行切割，但  未予測試，目前無法提供相應參數。
（5）RPA 反應 Buffer 對擴增至關重要，輕微的濃度差異，均可導致擴增效率大幅下降，甚至失敗。RPA BufferMix 為粘稠試劑，使用時務必保證加樣準確，Tip 頭中的殘液務必打入 EP 管中。

PCR實驗中應該注意的問題有哪些?

沒有ct值

檢測結果遇到沒有Ct值情況,排查是否有以下問題:

1、循環(huán)數不夠(一般不超過45循環(huán),不僅背景值提高,定量也不準);

2、PCR程序設置錯誤,檢測熒光信號的步驟有誤。一般SG法采用72℃延伸時采集,TaqMan法則一般在退火結束時或延伸時采集信號,另外熒光采集是否選中;

3、引物或探針降解。可通過PAGE電泳檢測引物和探針是否降解;

4、模板量可能降解或上樣量不足(不超過500ng,根據試劑盒說明書即可), 對未知濃度的樣本應從系列稀釋樣本的最高濃度做起;如果發(fā)生模板降解,應考慮樣本準備中雜質的引入及反復凍融的情況,建議將模板樣本小量分裝儲備,避免反復凍融;

5、引物探針是否合適(尤其是引物跨越內含子,以確保擴增基因組DNA;上下游引物Tm值超過4℃以上也會影響擴增)。

ct值過晚

在相對定量中, Ct值一般控制在15—25之間比較好,如果在絕對定量中, 對低拷貝數的樣品,Ct值會增大, 但是一般不宜超過40循環(huán), 否則定量不準確。

因此,判斷Ct值出現過晚是否屬于非正常情況, 需要根據具體實驗設計和目的進行。

1、擴增效率低。引物之間或者引物和探針的比例不合適, 需要進行優(yōu)化;引物或探針設計不合理, 需要重新設計;

2、PCR程序不合適, 改用三步法進行反應, 或者優(yōu)化退火/延伸溫度, 可以適當降低退火溫度; 退火/延伸時間短(可以在推薦的時間條件下延長10s);

3、MgCl2濃度不合適,增加鎂離子濃度等。PCR各種反應成分的降解或加樣量的不足;

4、PCR產物太長。PCR產物設計超過500bp;

5、模板中存在抑制物。用高純度模板進行PCR檢測或將模板進行稀釋。

PCR基本步驟及注意事項？

一、實驗原理

PCR是體外人工選擇性擴增DNA的一種方法，它類似于生物體內DNA的復制。在生物體內DNA復制需要模板、引物、DNA聚合酶、DNA解旋酶、 dNTPs；而體外PCR反應同樣需要類似的成分，有模板、引物、PCR Buffer、Taq酶、dNTPs。其中引物是人工設計的特定序列，實現對特定位置的擴增；PCR Buffer提供一個反應的緩沖環(huán)境；反應過程同生物體內一樣，DNA雙鏈打開，引物結合模板，延伸形成新鏈。而這些過程在生物體內靠DNA解旋酶解鏈，而在體外在通過控制反應溫度實現的。如常用94℃變性模板DNA打開雙鏈，在退火溫度處引物結合到模板上，最后在72℃完成延伸，并反復重復此過程即可實現對特定片段DNA的大量擴增。到第三循環(huán)開始才產生出和靶DNA區(qū)段相同的DNA分子，進一步循環(huán)地產生出靶DNA區(qū)段的指數加倍。

在擴增后期,由于產物積累,使原來呈指數擴增的反應變成平坦的曲線,產物不再隨循環(huán)數而明顯上升,這稱為平臺效應。平臺期(Plateau)會使原先由于錯配而產生的低濃度非特異性產物繼續(xù)大量擴增，達到較高水平。因此，應適當調節(jié)循環(huán)次數，在平臺期前結束反應， 減少非特異性產物。到達平臺期(Plateau)所需循環(huán)次數取決于樣品中模板的拷貝。

二、主要的成分

1.模板可以是多種形式，主要包括基因組DNA、質粒DNA、攜帶病毒的基因組DNA、PCR產物，cDNA等，但不能為RNA。對于不同類型的模板，其主要不同在于預變性的時間以及模板的量。一般對于大的基因組DNA預變性時間10min足夠，質粒DNA2min、攜帶病毒的基因組DNA預變性2min、PCR產物預變性2min即可。

注意cDNA為單鏈DNA，但仍可做PCR的模板，只不過在第一輪循環(huán)時只有一個引物結合，合成另一條鏈。從第二輪開始，兩個引物均與特異位點結合，從而實現了與常規(guī)PCR的接軌。而同作為單鏈的RNA卻不能進行PCR擴增，原因就在于實現PCR反應的是DNA聚合酶，只能特意識別DNA鏈。

2.對于模版的量來說，一般25ul體系DNA的質量為50—100ng。對于基因組DNA由于其結構比較復雜，提取的濃度也往往比較大，為防止?jié)舛冗^大對PCR造成影響，故需對提取的DNA進行梯度稀釋。否則濃度過高則可能會引起非特異性擴增。對于質粒及PCR產物由于其結構簡單，且提取濃度一般較低，則無需稀釋。

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