商品屬性：

RAPA3G DNA聚合酶為經電子重構架的第三代Taq DNA聚合酶，第三代DNA聚合酶具有高度的雜質耐受性、長片段擴增能力、高擴增成功率、高產量等特征，從而使得RAPA3G系列產品可用于粗制樣品的直接擴增，無需核酸純化步驟。雜質耐受性方面，該酶可耐受植物中的多糖多酚；全血、血清、血漿中的肝素、高濃度的血紅蛋白、甘油三脂；乙醇；胍鹽；SDS等強PCR抑制劑。在血液直擴PCR實驗中，RAPA3G PCR Mix性能與KAPA3G DNA聚合酶展現(xiàn)出同等的表現(xiàn)，其性能表現(xiàn)優(yōu)于二代聚合酶（血液擴增Hemo KlenTaq Mix）。在植物直擴PCR實驗中，RAPA3G PCR Mix在配合DNA釋放劑的條件下與KAPA3G Plant PCR試劑盒性能一致。長片段擴增能力方面，使用該酶可輕松擴增8kb的基因組片段，20kb的λ DNA，8kb的cDNA。該酶具有6kb/min以上的擴增速度，可顯著的縮短PCR的擴增時間，在常規(guī)測試條件下，10s的延伸時間可完成1kb的基因組DNA擴增。在PCR擴增成功率方面，與其它類型的PCR擴增試劑對比中，RAPA3G PCR Mix表現(xiàn)出的PCR擴增成功率。此外，該酶包含一定比例的RAPA HiFi超保真DNA聚合酶，因此其具有一定的保真性能（經藍白斑測試，其保真性能約為Taq DNA聚合酶的56倍）。另外，RAPA3G系列產品均采用專有的熱啟動技術，確保50°C以下無活性，僅有95°C加熱5min以后才能恢復其活性，因此可最大限度的提高擴增的特異性，減少非特異性產物的產生。該PCR Mix具有5'-3'的聚合酶活性、5'-3'的外切酶活性和3'-5'的外切酶活性，產物部分帶有"A"尾巴，部分為平末端，因此產物均可用于TA克隆或平端克隆。
特征和用途
快速擴增：具有6kb/min的擴增能力，1kb片段可在25min內完成擴增. 高成功率擴增：RAPA3G PCR Mix具有最高的PCR擴增成功率。 液體樣品直接擴增：全血、血清、培養(yǎng)細胞、尿液等樣本直接進行PCR擴增，無需核酸純化。 組織樣本直接擴增：葉片、種子、果實、動物組織等樣品，可以直接擴增，也可采用DNA釋放劑簡單處理后直接擴增，無需核酸純化。 長片段擴增：質粒、λ DNA 等簡單模板可以有效擴增>20 kb，基因組可以有效擴增>8 kb，cDNA可以有效擴增>8kb。 高保真擴增：保真度是 Taq DNA Polymerase 的56 倍。 高特異性：采用專有熱啟動技術，50°C以下無活性，僅有95°C加熱5min才能恢復酶活。
RAPA3G DNA聚合酶對抑制物耐受性
SDS 0.01% 胍鹽 0.25% 乙醇 5% 全血 15% 肝素 0.1IU/ml 血清 15% Trizol 0.5% 血漿 2% 血紅蛋白 30μM 尿液 5%
50μl體積建議添加的樣品量
抗凝全血 2.5 μl 培養(yǎng)細胞 >100個 血清 2.5 μl 組織 0.1mg 尿液 2.5 μl 毛發(fā)囊 1-3個 血漿 1 μl gDNA 1-400ng 植物葉片 2mm cDNA 1-400ng 植物粗提物 2-4 μl 質粒 0.1-10ng
儲存
長期儲存置于-20°C以下，可保存2年，避免反復凍融；短期使用置于4°C（3個月）保存，一經融化后請放置于4°C，勿再凍存。
反應實例
1. 模板適應性強，長片段和短片段都可有效擴增
Lane 1：λDNA 500bp, 2：λDNA 1kb, 3：λDNA 2kb, 4：λDNA 5kb, 5：λDNA 8kb, 6：λDNA 15kb, 7：λDNA 20kb, 8：human 500bp ,9：human 1kb, 10：human 2kb ,11：human 5kb, 12：human 8kb, 13：cDNA 166bp, 14：cDNA 552bp, 15：cDNA 960bp, 16：cDNA 1574bp, 17：cDNA 1705bp, 18：cDNA 2755b,p 19：cDNA 4128bp, 20：cDNA 7600bp, M：DNA Marker 10000
選取三種DNA模板，使用RAPA3G PCR Mix進行擴增，循環(huán)數統(tǒng)一為28 cycles，結果如上圖所示，對于不同種類DNA模板和不同長度的靶基因，RAPA3G PCR Mix均有良好的擴增性能。
2. 對于粗制樣品DNA具有的耐受性
分別以人全血、血清、葉片粗制品DNA以及大豆種子粗制品DNA為模板，使用RAPA3G PCR Mix進行PCR擴增，結果如上圖展示，各種粗制樣品都有良好的擴增，其中全血和血清可耐受15%。
3.擴增靈敏度高，λDNA模板低至0.1pg也可以有效擴增
以λDNA為模板，選取不同模板使用量，采用RAPA3G PCR Mix進行擴增2kb靶基因，循環(huán)數統(tǒng)一為28 cycles，結果如上圖所示，λDNA模板低至0.1pg也可以有效擴增

PCR基本步驟及注意事項？

一、實驗原理

PCR是體外人工選擇性擴增DNA的一種方法，它類似于生物體內DNA的復制。在生物體內DNA復制需要模板、引物、DNA聚合酶、DNA解旋酶、 dNTPs；而體外PCR反應同樣需要類似的成分，有模板、引物、PCR Buffer、Taq酶、dNTPs。其中引物是人工設計的特定序列，實現(xiàn)對特定位置的擴增；PCR Buffer提供一個反應的緩沖環(huán)境；反應過程同生物體內一樣，DNA雙鏈打開，引物結合模板，延伸形成新鏈。而這些過程在生物體內靠DNA解旋酶解鏈，而在體外在通過控制反應溫度實現(xiàn)的。如常用94℃變性模板DNA打開雙鏈，在退火溫度處引物結合到模板上，最后在72℃完成延伸，并反復重復此過程即可實現(xiàn)對特定片段DNA的大量擴增。到第三循環(huán)開始才產生出和靶DNA區(qū)段相同的DNA分子，進一步循環(huán)地產生出靶DNA區(qū)段的指數加倍。

在擴增后期,由于產物積累,使原來呈指數擴增的反應變成平坦的曲線,產物不再隨循環(huán)數而明顯上升,這稱為平臺效應。平臺期(Plateau)會使原先由于錯配而產生的低濃度非特異性產物繼續(xù)大量擴增，達到較高水平。因此，應適當調節(jié)循環(huán)次數，在平臺期前結束反應， 減少非特異性產物。到達平臺期(Plateau)所需循環(huán)次數取決于樣品中模板的拷貝。

二、主要的成分

1.模板可以是多種形式，主要包括基因組DNA、質粒DNA、攜帶病毒的基因組DNA、PCR產物，cDNA等，但不能為RNA。對于不同類型的模板，其主要不同在于預變性的時間以及模板的量。一般對于大的基因組DNA預變性時間10min足夠，質粒DNA2min、攜帶病毒的基因組DNA預變性2min、PCR產物預變性2min即可。

注意cDNA為單鏈DNA，但仍可做PCR的模板，只不過在第一輪循環(huán)時只有一個引物結合，合成另一條鏈。從第二輪開始，兩個引物均與特異位點結合，從而實現(xiàn)了與常規(guī)PCR的接軌。而同作為單鏈的RNA卻不能進行PCR擴增，原因就在于實現(xiàn)PCR反應的是DNA聚合酶，只能特意識別DNA鏈。

2.對于模版的量來說，一般25ul體系DNA的質量為50—100ng。對于基因組DNA由于其結構比較復雜，提取的濃度也往往比較大，為防止?jié)舛冗^大對PCR造成影響，故需對提取的DNA進行梯度稀釋。否則濃度過高則可能會引起非特異性擴增。對于質粒及PCR產物由于其結構簡單，且提取濃度一般較低，則無需稀釋。

PCR實驗中應該注意的問題有哪些?

沒有ct值

檢測結果遇到沒有Ct值情況,排查是否有以下問題:

1、循環(huán)數不夠(一般不超過45循環(huán),不僅背景值提高,定量也不準);

2、PCR程序設置錯誤,檢測熒光信號的步驟有誤。一般SG法采用72℃延伸時采集,TaqMan法則一般在退火結束時或延伸時采集信號,另外熒光采集是否選中;

3、引物或探針降解。可通過PAGE電泳檢測引物和探針是否降解;

4、模板量可能降解或上樣量不足(不超過500ng,根據試劑盒說明書即可), 對未知濃度的樣本應從系列稀釋樣本的最高濃度做起;如果發(fā)生模板降解,應考慮樣本準備中雜質的引入及反復凍融的情況,建議將模板樣本小量分裝儲備,避免反復凍融;

5、引物探針是否合適(尤其是引物跨越內含子,以確保擴增基因組DNA;上下游引物Tm值超過4℃以上也會影響擴增)。

ct值過晚

在相對定量中, Ct值一般控制在15—25之間比較好,如果在絕對定量中, 對低拷貝數的樣品,Ct值會增大, 但是一般不宜超過40循環(huán), 否則定量不準確。

因此,判斷Ct值出現(xiàn)過晚是否屬于非正常情況, 需要根據具體實驗設計和目的進行。

1、擴增效率低。引物之間或者引物和探針的比例不合適, 需要進行優(yōu)化;引物或探針設計不合理, 需要重新設計;

2、PCR程序不合適, 改用三步法進行反應, 或者優(yōu)化退火/延伸溫度, 可以適當降低退火溫度; 退火/延伸時間短(可以在推薦的時間條件下延長10s);

3、MgCl2濃度不合適,增加鎂離子濃度等。PCR各種反應成分的降解或加樣量的不足;

4、PCR產物太長。PCR產物設計超過500bp;

5、模板中存在抑制物。用高純度模板進行PCR檢測或將模板進行稀釋。

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